Scarless Editing の中核技術。相同組換え修復（HDR）に基づくゲノム編集の効率を最大化することで、高品質と低コストを両立します。編集対象部位の近傍に適切なガイド RNA を設計できない場合や、編集サイズが大きすぎて効率が低く目的細胞を得にくい場合でも、ガイド RNA やドナー DNA の詳細な最適化・スクリーニングを必要とせず、統一されたゲノム編集プロセスで進められます。
Two-step HDR を用いた Scarless Editing は、従来のゲノム編集法における課題であった「ゲノム DNA 配列の書き換え」の難易度を大きく下げます。従来法では、遺伝子を破壊する（delete キーを押す）ことは非常に容易ですが、A・T・C・G の文字を望み通りに入力するには、ガイド RNA とドナーベクターの詳細な設計・最適化に加え、運も必要でした。
遺伝子不活性化
遺伝子の破壊 / タンパク質機能の不活性化
DNA 配列の書き換え
単塩基置換 / 高精度塩基編集
一般に、相同組換え修復（HDR）に基づくゲノム編集は、単純な遺伝子破壊よりも難しいとされます。しかし HDR ベースのゲノム編集の中にも、難しいケースと易しいケースがあります。最も容易な HDR ベースのゲノム編集は、選択マーカーを挿入し、そのマーカーを基準として目的通り編集された細胞を濃縮できるケースです。Two-step HDR は、ガイド RNA 標的から離れた位置での編集、単塩基置換、大きな配列の挿入といった最も困難なタスクを、最も容易な選択マーカーを用いたゲノム編集を 2 回繰り返すだけで、編集の痕跡を残すことなく実現する手法です。
上図の青色で示された最初の DSB（二本鎖切断、ガイド RNA の標的）の位置と、最終的に編集される位置をご覧ください。両者は異なります。この特性により、Two-step HDR に基づく Scarless Editing は前例のない設計柔軟性を実現します。従来のゲノム編集法では、編集はガイド RNA を設計した位置でしか発生しませんでした。つまり、編集対象部位に適切なガイド RNA 標的がない場合、編集は不可能でした。
従来法
限定的な編集範囲
Scarless Editing 技術は、従来の CRISPR/Cas9 では困難だった単塩基置換を効率的に行うために開発されました。従来技術では、単塩基置換に成功しても Cas9 の配列認識におけるミスマッチ許容性により再切断を抑制できず、実用性を高めるために同義変異、すなわち編集の傷を追加する必要がある場合が多くありました。さらに、ガイド RNA 標的が編集部位と重ならない場合、編集は不可能でした。Two-step HDR 法はそのようなケースでも確実に編集を行うことができます。
従来法
編集の傷としての同義変異
Two-step HDR は、100 塩基以上の大規模なゲノム編集にも適しています。従来技術と異なり、選択マーカー除去後に編集の痕跡を残しません。
Conventional methods
Editing scar remains
この機能は Two-Step HDR の柔軟性を最もよく表しています。選択マーカーで置換されたゲノム配列は自由に書き換え可能です。異なる位置に SNP を持つ複数の細胞株、レポーター株、およびそれらの組み合わせを並列で作製できます。選択マーカー付き細胞株がストックされていれば、後から別色のレポーターが必要になった場合でも、レポーターの色を即座に変更できます。